明膠酶譜分析試劑盒

MMP-2&MMP-9明膠(jiao)酶譜法檢測試劑盒說明書

1. 簡介：

基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP)以無活(huo)性(xing)的(de)酶(mei)原(yuan)形式分泌(mi)，活(huo)化后(hou)能夠降(jiang)解細胞外基質的(de)膠(jiao)原(yuan)蛋白，又稱膠(jiao)原(yuan)酶(mei)。通過影響細胞外基質，膠(jiao)原(yuan)酶(mei)參與胚胎(tai)發(fa)育、形態發(fa)生、組織重塑等過程，并參與炎癥、腫瘤(liu)、心血(xue)(xue)管、神經等許多疾病過程。血(xue)(xue)漿與組織中的(de)MMP-2、MMP-9參與各(ge)種生理與病理過程，其(qi)在診斷和治療中的(de)意義日益受到(dao)重視。

2. 檢測(ce)原理：

本試劑(ji)盒采(cai)用(yong)酶譜法(fa)(Zymography)檢(jian)測MMP-2、MMP-9 活性。Zymography 是(shi)一種廣(guang)為(wei)使用的(de)、基(ji)于SDS-PAGE 電泳和(he)反相(xiang)凝膠染色(se)的蛋白酶檢測方(fang)法(fa)，其靈敏度可達1 nM，高(gao)于ELISA方法，其基本原理1和(he)程序是：制備加有(you)膠原酶底物(wu)的SDS-PAGE 凝(ning)膠，含蛋(dan)白酶的(de)樣品在(zai)此凝(ning)膠中進行電泳，電泳結束(shu)后取出凝(ning)膠與酶反應(ying)Buffer 孵(fu)育，凝膠染色(se)與脫色(se)。凝膠中由于含底物蛋(dan)白而被深染，形成深色(se)背景，但在有(you)蛋(dan)白酶條帶的(de)位置，蛋(dan)白酶將降解凝膠中的(de)底物蛋(dan)白，因而不被染色(se)而形成透亮(liang)區域，從而能同時(shi)指示MMP-2、MMP-9 的(de)大小(xiao)位置(酶譜)及活性(xing)。本(ben)試(shi)劑盒(he)提供MMP-2、MMP-9 特異(yi)蛋白底物(wu)及酶學反應緩沖液，可檢測少至0.1~0.5 μl 血(xue)液中的MMP-2、MMP-9 酶譜及(ji)活性，檢測靈敏度~1nM。試劑盒可進行(xing)50次標(biao)準小膠檢(jian)測(ce)，如果小膠加樣孔為10~15個，則總計可檢(jian)測500~750個樣(yang)品。

3. 檢測目的:

本試劑盒用于(yu)檢測MMP-2、MMP-9 酶譜及活性(xing)（Detect MMP2 and MMP9 as low as 1nM）。

4.  試劑盒組成與儲存(cun)：

A. 2 × SDS-PAGE non-reducing buffer 1.5 ml μl, ?20 oC；

B. 10 × Substrate G, 50 ml, ?20 oC；

C. 10 × Buffer A, 50 ml, 4 oC, 使用(yong)時用(yong)蒸餾水稀釋(shi)；

D. 10 × Buffer B, 50 ml, 4 oC, 使用(yong)時用(yong)蒸餾水稀(xi)釋(shi)；

E. SDS-PAGE 凝膠蛋(dan)白質(zhi)考馬斯亮藍染(ran)色液, 4 oC。

5.檢測步驟：

5.1 制(zhi)備含MMP底(di)物蛋白的SDS-PAGE凝膠：分離膠濃度(du)為(wei)8%。按(an)照(zhao)標準程序制備SDS PAGE凝膠。將(jiang)10 × substrate G 融化(hua)，并90 oC 加熱5分(fen)鐘(zhong)。分(fen)別在濃(nong)縮膠和(he)分(fen)離膠中額(e)外加入10 × substrate G 并使(shi)之(zhi)稀釋10倍，混勻后加入過(guo)硫(liu)酸銨和TEMED，等(deng)待凝膠聚合。

5.2 待測樣品1:1 稀(xi)釋于2 × SDS-PAGE non-reducing buffer (用完后(hou)可自行配制：4% SDS, 100 mM Tris-Cl pH6.8, 20% glycerol, 0.02% bromophnol blue)，混(hun)合(he)后直接上(shang)樣。切勿加熱變性，并且(qie)僅使(shi)用(yong)不加還原劑的上(shang)樣緩沖(chong)液。可通過預(yu)試驗確定加樣量(liang)，使(shi)用(yong)普通蛋白預(yu)染(ran)Marker 即可。

陽性對(dui)照(可選(xuan)步(bu)驟)：可取(qu)人、小鼠、大鼠或兔100μl 全血與100μl 2 × SDS-PAGE nonreducing buffer 等體(ti)積混(hun)合，取(qu)5-15μl 上樣(yang)。

注：因為全血(xue)成分(fen)復(fu)雜,MMP活性較低，的方法(fa)是將(jiang)全血(xue)中白細胞進行(xing)分(fen)離做陽性對照

5.3 低電流恒流電泳，每一塊(kuai)小膠電流為20 mA/gel。溴酚藍跑出凝膠(jiao)前沿時結束電泳。

5.4 洗滌凝膠(jiao)：取出凝膠(jiao)，去除濃縮膠(jiao)，放(fang)入容器內。可先用適量蒸(zheng)餾水沖(chong)洗凝膠(jiao)，然后加入10 ml 1× Buffer A(用蒸餾水稀釋(shi))，室溫漂洗(xi)凝膠(jiao)2 × 30 分鐘。中間換(huan)液。

5.5 孵育：倒掉Buffer A。加入10 ml 1× Buffer B(蒸餾水稀釋)，室溫(wen)或37oC 孵(fu)育1~5 小時。陽性對照或者血中的(de)MMP 通常37oC 孵育1 小(xiao)時即(ji)可顯示。如MMP 活性(xing)低，應延長孵育時間為(wei)10小時或過夜。

5.6 顯(xian)色：倒掉Buffer B，加(jia)入SDS-PAGE凝膠(jiao)蛋(dan)白(bai)質(zhi)考馬斯亮藍染(ran)色液（操作步(bu)驟見后(hou)面所(suo)附SDS-PAGE凝膠蛋白質考(kao)馬斯亮藍(lan)染色液說明書）。凝膠的大部分區域被(bei)深(shen)染，在有MMP 條帶的位置不被染色而形(xing)成透亮區域。

透明區域(yu)的(de)位置和范圍(wei)指示MMP-2、MMP-9 的大小位置(酶譜)及(ji)活性。陽性對照將(jiang)在66~72 (MMP-2)、92 (MMP-9)、130 (proMMP-9)、225 (proMMP-9) kDa位(wei)置出現透明條帶。

5.7 條帶掃(sao)描：將凝膠放在掃(sao)描儀上掃(sao)描。雖(sui)然(ran)MMP條帶透(tou)明，但凝(ning)膠(jiao)背景并非真正全黑。解決辦法：可(ke)用(yong)非透(tou)射光掃描(miao)，或用(yong)軟件圖像處理程(cheng)序調整背景顯示為灰度顯示，并盡量設(she)置為黑色。MMP 條帶(dai)則為(wei)白(bai)色(se)，這種背景黑條帶(dai)白(bai)的格式(shi)是英文論(lun)文中zui常見(jian)的格式(shi)。

明膠酶譜法試劑盒

6.說明：

1. 10 mM 能夠(gou)EDTA*抑(yi)制MMP活性。

2. 凝膠(jiao)(jiao)干燥(zao)：可使用聚丙烯酰胺凝膠(jiao)(jiao)干膠(jiao)(jiao)裝置室溫快速干燥(zao)凝膠(jiao)(jiao)，作為*記錄保留。

明膠酶譜分析試劑盒

7.參考文(wen)獻(xian)：

1. Nagase H and Woessner JF. Matrix Metalloproteinases. J Biol Chem, 1999, 274, 21491-21494

2. Heussen C, and Dowdle EB. Electrophoretic analysis of plasminogen activators in polyacrylamide

gels containing sodium dodecyl sulfate and copolymerized substrates. Anal. Biochem，1980, 102,196–202

SDS-PAGE 凝膠蛋白質考馬斯亮藍染(ran)色液說明書

常規(gui)考馬斯(si)亮藍SDS-PAGE 凝膠蛋白質(zhi)染色是(shi)實驗室常用的凝膠染色方(fang)法。銀染方(fang)法雖(sui)然靈敏度(du)高，但所需試劑復雜(za)并且(qie)有(you)(you)毒(du)有(you)(you)害，操作步驟繁(fan)瑣，難以控制獲得好的染色效果。

染色步驟：

1. 此染色液即(ji)為工作(zuo)液，使用時直接將聚丙(bing)烯酰胺凝膠放在培(pei)養皿(min)中以考馬斯(si)亮藍染色液覆蓋凝

膠，并緩(huan)慢搖動2h；

2. 傾去(qu)染色液，用脫色液沖洗凝膠(jiao)；

3. 以(yi)脫(tuo)色液覆蓋(gai)凝(ning)膠，緩慢搖動2h，傾去脫(tuo)色(se)(se)液，再加入新脫(tuo)色(se)(se)液進(jin)行脫(tuo)色(se)(se)，直至獲得(de)清晰的藍色(se)(se)的條(tiao)帶和干凈(jing)的背景（通常(chang)此過程需要(yao)2～4h，也可脫色過夜至(zhi)清晰(xi)的藍色的條帶和(he)干(gan)凈的背景）；

4. 對凝膠進行分析和照相，凝膠可放置在7％的乙酸中保存。也(ye)可用凝(ning)膠干(gan)膠裝(zhuang)置（P2000）對

凝(ning)膠進行處(chu)理后保存。

安全(quan)性(xing)：含有甲醇，無特(te)殊(shu)毒性(xing)，按一(yi)般化學品(pin)操(cao)作規程處理。

說明：

1. 染色液配(pei)方：0.25g 考馬(ma)斯亮藍R250+420ml 甲醇+100ml 冰(bing)乙酸(suan)，定容至(zhi)1000ml，混合1h 后用

Whatman 1 號濾紙(zhi)過濾，于室溫可(ke)無限期保(bao)存；

2. 脫色液配方：冰醋酸:甲(jia)醇:水＝7:5:88（V:V:V）；

3. 保存液：7％冰(bing)醋酸；

4. 凝膠染(ran)色(se)之后，染(ran)色(se)液可以回收利用，裝入(ru)新容(rong)器內，室溫或4 oC 保(bao)存，可反復使用(yong)2-4 次。

所有產品僅供(gong)科研(yan)使用(yong)，不得用(yong)于食用(yong)，醫(yi)療等其它(ta)用(yong)途。